O atual edifício foi erguido a partir de 1517 em substituição a uma igreja gótica anterior. O autor do projeto em estilo manuelino foi, provavelmente, Francisco de Arruda. A abertura ao culto foi realizada em 1537, com as obras ainda inacabadas. Da época manuelina data a estrutura geral do templo, uma igreja-fortaleza ameiada de três navescoberta com abóbada nervurada. O nártex de entrada sob a torre e o portal lateral também são manuelinos. O portal principal, de Miguel de Arruda, data de 1550 e tem caráter renascentista.

Em 1570 a igreja passou a ser sede da diocese de Elvas, ascendendo assim a catedral (Sé). Nos séculos XVII e XVIII foram realizadas inúmeras modificações estilísticas que enriqueceram o interior. Na época do bispo D. Lourenço de Lencastre (1759-1780), em particular, a Sé ganhou vários altares em mármore de Estremoz, como o da capela-mor realizado por José Francisco de Abreu. Também nessa época foi realizada a obra de talha dourada do órgão, atribuído ao italiano Pascoal Caetano Oldovini. Destaca-se também a sala do cabido, construída no século XVII.